TÉCNICA PARA OBTENÇÃO DE LÂMINAS (preparados histológicos permanentes)

1º Passo. Colheita do material - é a obtenção da peça, por biópsia (animal vivo) ou necropsia (animal morto).

2º Passo. Fixação - o tratamento assim denominado visa impedir a destruição das células por suas próprias enzimas (autólise), ou bactérias. Este tratamento é feito imediatamente após a retirada do material (biópsia), ou até antes (fixação por perfusão do animal). A fixação visa ainda endurecer os tecidos, tornando-os mais resistentes e favoráveis às etapas subsequentes da técnica histológica.

Resumindo, pode-se dizer que a fixação é o tratamento da peça histológica a fim de que possamos observar ao microscópio os componentes teciduais, com a morfologia e a composição química semelhantes às existentes no ser vivo. A fixação pode ser feita por processos físicos ou químicos. A fixação química, mais usada em Histologia, é feita por fixadores que podem ser simples ou compostos. Como exemplo de fixador simples temos o formol e, de composto, citamos o líquido de Bouin (uma mistura de formol, ácido pícrico e ácido acético).

3º Passo. Desidratação - visa retirar a água dos tecidos, a fim de permitir a impregnação da peça com parafina. Para isto, a peça é submetida a banhos sucessivos em álcoois de teor crescente (ex.: álcool a 70%, 80%, 90% e 100%).

4º Passo. Diafanização - visa impregnar a peça com um solvente de parafina. O mais usado é o xilol.

5º Passo. Impregnação pela parafina fundida - tem a finalidade de permitir a obtenção de cortes suficientemente finos para serem observados ao microscópio. Para isso os tecidos devem ser submetidos a banhos de parafina a 60°C, no interior da estufa. Em estado líquido, a parafina penetra nos tecidos, dando-lhes, depois de solidificada, certa dureza.

6º Passo. Inclusão - é a passagem da peça que estava na estufa para um recipiente retangular (forma) contendo parafina fundida que, depois de solidificada à temperatura ambiente, dá origem ao chamado “bloco de parafina”. A inclusão pode também ser feita com celoidina, gelatina ou resorcina epóxi, sendo estas últimas usadas para microscopia eletrônica.

7º Passo. Microtomia - é a etapa em que se obtém delgadas fatias de peças incluídas na parafina, através de um aparelho chamado micrótomo, que possui navalha de aço. A espessura dos cortes geralmente varia de 5 a 10 um (micrômetros). (1 um = 0,001 mm)

8º Passo. Extensão - os cortes provenientes da microtomia são “enrugados”. Para desfazer estas rugas, são esticados num banho de água e gelatina a 58°C, e “pescados” com uma lâmina. Leva-se então, à estufa a 37°C, por 2 horas, para que se dê a colagem do corte à lâmina, pela coagulação da gelatina contida na água quente.

9º Passo. Coloração - tem a finalidade de dar contraste aos componentes dos tecidos, tornando-os visíveis e destacados uns dos outros. Para realizá-la, são observados 3 itens:

• Eliminação da parafina - por meio de banhos sucessivos em xilol, benzol ou toluol.
• Hidratação - é executada quando o corante utilizado é solúvel em água. Deve ser gradativa, com álcoois de teor decrescente, para evitar o rompimento dos tecidos.
• Coloração - os corantes são compostos químicos com determinados radicais ácidos ou básicos que possuem cor, e apresentam afinidade de combinação com estruturas básicas ou ácidas dos tecidos. Rotineiramente, usa-se hematoxilina, corante básico, que se liga aos radicais ácidos dos tecidos, e eosina, corante ácido que tem afinidade por radicais básicos dos tecidos. Os componentes que se combinam com corantes ácidos são chamados acidófilos e os componentes que se combinam com corantes básicos são chamados basófilos. Por exemplo, os núcleos das células, onde predominam substâncias ácidas (DNA), são basófilos, ou seja, coram-se pela hematoxilina (corante básico de cor roxa); por sua vez, o citoplasma, onde predominam substâncias básicas (proteínas estruturais), é acidófilo, corando-se pela eosina (corante ácido de cor rosa).

10º Passo. Desidratação - visa retirar a água, quando os corantes utilizados forem soluções aquosas, a fim de permitir perfeita visualização dos tecidos, pois a água possui índice de refração diferente do vidro, e ainda prevenir a difusão dos corantes. Para isto usam-se banhos em álcoois de teor crescente.

11º Passo. Diafanização - a diafanização é feita com xilol, a fim de tornar os cortes perfeitamente transparentes.

12º Passo. Montagem - é a etapa final da técnica histológica, e consiste na colagem da lamínula sobre o corte, com bálsamo do Canadá, que é solúvel em xilol e insolúvel em água. A lamínula impede que haja hidratação do corte pela umidade do ar ambiente, permitindo então que estas lâminas se mantenham estáveis por tempo indefinido. Após a montagem, levam-se as lâminas à estufa, para secagem do bálsamo do Canadá.